（一）　原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

（二）　操作步驟
     方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3.　加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二　用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

（三）　試劑器材
1.　試劑
（1）　包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO3　1.59克　NaHCO3　 2.93克　　加蒸餾水至1000ml
    （2）　洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
（3）　稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克　加洗滌緩沖液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
（4）　終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。
（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml　0.1M 檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml　加蒸餾水50ml。
（6）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2　32μl
（7）　ABTS使用液:ABTS　0.5mg　底物緩沖液（PH5.5） 1ml　3％H2O2　2μl
（8）　抗原、抗體和酶標記抗體。
（9）　正常人血清和陽性對照血清。
2.　器材:
（1）　聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。