1．  固定：用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。 
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長期保存。 
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。 
2．組織脫水，透明：時(shí)間不能太長，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。 
3．切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?nbsp;
4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時(shí)間太長，抗原容易丟失。 
5．蠟塊及切片的保存：在4℃保存 elisa試劑盒
6．脫片問題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。 
7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。 
8．暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書)。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。 
9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉 
10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配"的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。 
11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。 
12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。 
13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

DAB法 顯示過氧化物酶

〔原理〕  過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2→A（供氫體的氧化物）+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知，有稱為復(fù)合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氫體）復(fù)合體生成，在復(fù)合體zui后分解為酶和水時(shí)，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì)，如奈酚和聯(lián)苯胺。

免疫組化染色步驟（以ABC法為例）elisa試劑盒

溶液的配置：

1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份

2. 檸檬酸鹽緩沖液：

貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水

        0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水

工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水→0.01M檸檬酸鹽緩沖液

3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇→充分混勻

4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水

5. 稀釋抗體：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （臨用前配）

6. 酒精的配置

染色步驟：一步法

1. 載玻片 烤箱中 60℃ 40′。

2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室溫 15′。

3. 脫水，100%→95%→85%→75%酒精，每級(jí)均為3′。

4. 蒸餾水沖洗，PBS 5′﹡1

5. 微波爐修復(fù)抗原：0.01M 檸檬酸鹽緩沖液，99℃ 肺 20′，心腎 12′

6. PBS 3′*3

7. 0.03% H2O2-甲醇，室溫20′

8. PBS沖洗，PBS 3′*3，甩干或紙巾吸去多余液體（勿碰到組織），PAP Pen劃境線。

9. block solution 封閉抗原，室溫10′。

10. 傾出封閉液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃過夜或37℃ 1～2h。

11. PBS沖洗，3′*3。

12. 除去PBS，滴加A增強(qiáng)劑，室溫25′。

13. PBS沖洗，3′*3。

14. 除去PBS，滴加B劑，室溫35′。

15. PBS沖洗，3′*3。同時(shí)配置DAB顯色劑。

16. 除去PBS，DAB顯色10′（在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時(shí)間）。蒸餾水沖洗。

17. 復(fù)染：蘇目素均勻滴加2滴，40′′，蒸餾水沖洗，60℃溫水泡半分鐘。

18. 脫水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每級(jí)3′。

19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。

18. 封片：中性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡），60℃ 0.5h烘干。

結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原X的定位。elisa試劑盒

拍照

1. 更換樣品時(shí)，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動(dòng)！所有的樣品必須一次拍攝*。特別是在拍攝過程中，不要一會(huì)用高倍鏡，一會(huì)用低倍鏡，來回切換物鏡。

2. 數(shù)碼相機(jī)必須設(shè)置為手動(dòng)曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時(shí)間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動(dòng)白平衡功能給關(guān)掉

3. 免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。