季銨鹽沉淀法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物并不與中性多糖產(chǎn)生沉淀，但當(dāng)溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時(shí)，也會(huì)與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽有十六烷基*胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉淀出來(lái)，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會(huì)被沉淀出來(lái)。2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來(lái)分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹(shù)脂分離中性多糖。纖維素柱層析 纖維素柱層析對(duì)多糖的分離既有吸附色譜的性質(zhì)，又具有分配色譜的性質(zhì)，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先后順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的zui后出柱，與分級(jí)沉淀法正好相反。纖維素陰離子交換柱層析 zui常見(jiàn)的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或堿型），洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前zui為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開(kāi)來(lái)，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強(qiáng)度不低于0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質(zhì)的分離有很大的差別。在多糖分離時(shí)，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無(wú)機(jī)鹽及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進(jìn)行分離。凝膠柱層析法不適合于粘多糖的分離。親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質(zhì)和糖蛋白）做親和色譜來(lái)分離多糖。高壓液相層析2.2.5 制備性區(qū)域電泳 分子大小、形狀及所負(fù)電荷不同的多糖其在電場(chǎng)的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開(kāi)，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加于柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負(fù)極的），下端為負(fù)極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時(shí)間為5－12小時(shí)。電泳完畢后將玻璃粉載體推出柱外，分割后分別洗脫、檢測(cè)。該方法分離效果較好，但只適合于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。2.2.6 金屬絡(luò)合物法 常用的絡(luò)合劑有費(fèi)林溶液、化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。2.2.7 其它方法：純化除采用上述方法外，還有超過(guò)濾法（多糖溶液通過(guò)各種已知的超過(guò)濾膜就能達(dá)到分離）、活性炭柱色譜。另?yè)?jù)報(bào)道，國(guó)外多采用的LKB柱色譜系統(tǒng)，用比旋度、示差折射及紫外檢測(cè)多糖，各組分的峰位自動(dòng)記錄，分離效果好且方便。2.3 多糖純度的鑒定2.3.1超離心法 由于微粒在離心力場(chǎng)中移動(dòng)的速度與微粒的密度、大小和形狀有關(guān)，故當(dāng)將多糖溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組分均一的多糖，則應(yīng)呈現(xiàn)單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配制成1％－5％的溶液，然后進(jìn)行密度超離心，待轉(zhuǎn)速達(dá)到恒定后（通常是60000r/min），采用間隔照明的方法檢測(cè)其是否為單峰。2.3.2高壓電泳法 由于中性多糖導(dǎo)電性差、分子量大、在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度慢，故常將其制成硼酸絡(luò)合物進(jìn)行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡(luò)合物就不同，在電場(chǎng)作用下的相對(duì)遷移率也會(huì)不同，故可用高壓電泳的方法測(cè)定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙酰銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強(qiáng)度約為30－50V/cm，時(shí)間是30－120min。由于電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，所以要有冷卻系統(tǒng)，將溫度維持在0℃左右，否則會(huì)燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發(fā)生的顏色反應(yīng)在多糖上不明顯，電泳后常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過(guò)碘酸希夫試劑等。2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開(kāi)劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大于40。2.3.4旋光測(cè)定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉淀。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉淀，比較二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。2.3.5其它方法：能團(tuán)摩爾比恒定法，即如為純品兩次分離所得產(chǎn)物的官能團(tuán)如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應(yīng)該恒定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國(guó)常用高壓液相法來(lái)檢測(cè)多糖純度，結(jié)果可靠。    必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結(jié)果才能肯定。