ELISA試劑盒植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)吸附免疫分析(ELISA),由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一種類型。
一、材料、 儀器 設(shè)備及試劑
(一)材料:高等植物、真菌、藻類等組織或器官。
(二) 儀器 設(shè)備:1. 酶聯(lián)免疫檢測儀;2. 高速冷凍離心機;3. 恒溫箱;4. 連續(xù)進樣器;5. 渦旋儀;6. 96孔微孔板;7. 離心管;8. 研缽或勻漿器;9. 試管。
(三) 試劑 1. 洗滌緩沖液:0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液(PBS),含0.05%Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”復合物;3. 0.1%封閉蛋白(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素標準品母液,及參比系列溶液(按雙倍或四倍系列稀釋);6. HRP標記激素,或HRP-GARIG;7. 鄰苯二胺(OPD)基質(zhì)液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30%H 2 O 2 12.5μl。
二、實驗步驟
固相抗體型ELISA。
1. 用方陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度;
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔,4℃濕盒,12h;
3. 棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干;
4. 加入100μl抗激素Mab溶液,37℃70min;
三、計算
以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的
OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),
即為樣品的實際濃度。 注意事項
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未 用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本 OD 值 大于標準品孔*孔的 OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n 倍)后再測定,計 算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。