ELISA是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定量分析方法。樣本的處理對于 Elisa 實驗的成功有舉足輕重的作用。
 

　　利用 ELISA 進(jìn)行檢測的樣本類型包括：血液(血清、血漿)，組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清，皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、陰道分泌物等。
 

　　下面我們就常用的樣本處理方法：
 

　　血液樣本
 

　　血液采取后應(yīng)盡快進(jìn)行處理，使血清(漿)從與血細(xì)胞接觸的全血中分離出來。
 

　　Q: 血清與血漿的區(qū)別?
 

　　A: 血清是血液凝固后缺少纖維蛋原的血漿，故血漿中除尚含有纖維蛋白原和 抗凝劑外，其他成份均等同于血清。
 

　　Q: 選擇血清還是血漿樣本？
 

　　A: 由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產(chǎn)物。如果測凝血因子建議選擇血漿樣本；同時血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對待檢測指標(biāo)有影響，建議選擇血清樣本。
 

　　大多數(shù)情況下二者均可以選擇。
 

　　處理方法：
 

　　血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4 度過夜，然后1000×g 離心20分鐘，取上清即可。這是一個讓血液自然凝固的過程，溫度越低，凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑。
 

　　血漿：血漿樣本需要抗凝，一般建議用2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸櫞酸鈉作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2~8度1000g離心15分鐘，取上清即可檢測。根據(jù)待檢測目標(biāo)物的性質(zhì)不同選取不同的抗凝劑。
 

　　枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)：Ca2+有凝血作用，枸櫞酸鈉能與血液中的鈣離子形成可溶性的螯合物，從而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的濃度和血液1:9, 106mmol/L的濃度和血液1:4
 

　　缺點：血液中溶解度低，抗凝作用較弱。
 

　　優(yōu)點：對凝血因子有很好的保護(hù)作用，大部分凝血試驗都可用枸櫞酸鈉抗凝。
 

　　二胺四乙酸(EDTA)鹽：與血液中的鈣離子結(jié)合形成配位化合物， 從而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10
 

　　優(yōu)點：對紅細(xì)胞和白細(xì)胞形態(tài)影響小。
 

　　缺點：影響血小板的聚集。不適用于凝血實驗和血小板功能相關(guān)實驗的檢 測。
 

　　肝素：通過與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，增強(qiáng)抗凝血酶的作用，滅活絲氨酸蛋白 酶，從而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。肝素鈉 1g/L 與血液 1:10
 

　　優(yōu)點：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血、能耐高溫。
 

　　缺點：引起白細(xì)胞聚集。肝素抗凝血應(yīng)于短時間內(nèi)使用，否則放置過久血 液又可凝固。
 

　　組織樣本(組織樣本一般是制成組織勻漿)
 

　　處理方法：
 

　　1)取適量組織塊，于預(yù)冷 PBS(0.02mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液， 稱重后備用(組織塊較大需先剪碎后再勻漿)；
 

　　2)可同時選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃 勻漿器，加入 5-10ml 預(yù)冷 PBS(組織與 PBS 的質(zhì)量體積比建議為 1:5，即 1g 樣 本加入 5ml PBS)進(jìn)行充分研磨(有條件實驗室可選用機(jī)器勻漿)，該過程需在冰 上進(jìn)行；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理(超聲破碎過 程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù) 2 次)。
 

　　3)將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。
 

　　4)如果樣本需要長期保存，請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?。根?jù)實驗需要，組織勻 漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦 組織會有假陽性反應(yīng)。
 

　　細(xì)胞樣本
 

　　根據(jù)目的物所在部位，可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本。需要注意的是：
 

　　因該類樣本干擾因素較多，所以可能存在檢測不出的情況。
 

　　如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本；
 

　　如果目的物主要存在于胞內(nèi)，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類型。
 

　　處理方法：
 

　　細(xì)胞培養(yǎng)上清：處理方法相對簡單，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，1000×g 離心 20 分 鐘，取上清即可檢測。
 

　　細(xì)胞裂解液：
 

　　1)貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞(懸浮細(xì)胞可直接離心收 集)
 

　　2)將收集到的細(xì)胞用冷 PBS 洗 3 次
 

　　3)物理方法裂解細(xì)胞(可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融)：
 

　　i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞 懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂；
 

　　ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 度以下冰凍，室溫融解，反復(fù) 3 次，使細(xì)胞溶脹破碎；
 

　　4)將標(biāo)本于 2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。
 

　　一般情況下，物理方法如反復(fù)凍融，勻漿等方法會比化學(xué)方法好，因為化 學(xué)方法會引入酸或堿，可能會對 elisa 實驗產(chǎn)生影響。我們也做了相關(guān)實驗來評 測化學(xué)提取液和洗滌劑對 ELISA 檢測的影響，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT。
 

　　痰液
 

　　1)選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍于痰量的 0.1% DTT(二硫蘇糖醇)， DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反復(fù)吹打，漩渦器振蕩 15s，37 度恒溫水浴振蕩 5 分鐘；
 

　　2)加入兩倍于痰量的 PBS 緩沖液繼續(xù)振蕩 15-20 分鐘，150 目的金屬絲網(wǎng)過濾，1500 rpm 離心 10 分鐘吸取上清液檢測。
 

　　糞便
 

　　盡量采集干的糞便，糞便過稀會較難處理且降低檢測的準(zhǔn)確性。采集的重量應(yīng)大于50mg，將糞便用PBS洗3次(最終糞便質(zhì)量：PBS 體積=1:9)，用超聲粉碎(或搗碎)后于5000×g離心10分鐘，取上清檢測。
 

　　唾液
 

　　將樣品收集于離心管后在-70 度冰凍 1 小時。在冰上融化樣品后，2000×g 離 心 10 分鐘，取上清檢測。
 

　　皮膚組織
 

　　用勻漿機(jī)加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮膚組織使其充分溶解，離心 20 分 鐘，10000 g/分鐘，取上清檢測。
 

　　牛乳
 

　　于4度，12000g/分鐘離心30分鐘，去除上層脂肪，以及下層沉淀，取中間層樣本用于檢測。
 

　　腦脊液、肺泡灌洗液
 

　　樣本收集后于1000×g 離心20分鐘，離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20度，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
 

　　處理樣本的過程就是收集目標(biāo)蛋白的過程，由于蛋白容易變性，降解，故 該過程應(yīng)盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要，尤其注意不要反復(fù)凍融， 樣本處理之后可分裝密封保存，4 度保存應(yīng)小于1周，-20 度不應(yīng)超過1個月，-80 度不應(yīng)超過2個月。
 

　　在標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第一步，以上就是關(guān)于Elisa特殊樣本處。