PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。下面歸納PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)過程的污染與對策如下：

一、污染原因：

(一)標(biāo)本間交叉污染:

標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:

主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:

這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.

(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室，這個問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。

污染的監(jiān)測：

一個好的實(shí)驗(yàn)室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

二、防止污染的方法：

(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室：

將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染：

是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(三)預(yù)混和分裝PCR試劑：

所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨?/p>

陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。

(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本