免疫熒光實(shí)驗(yàn)原理很簡單，其實(shí)就是使用熒光二抗，并在熒光顯微鏡下采集圖像，其它的和IHC或ICC區(qū)別不大。實(shí)驗(yàn)過程常見問題分析：

1、目標(biāo)蛋白的熒光很弱，導(dǎo)致組間差異并不明顯，造成假陰性結(jié)果

這種情況出現(xiàn)后，首先要檢查一下抗體對不對，是否適用于你的預(yù)處理組織。一個(gè)典型的例子就是，有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應(yīng)用于石蠟切片，就會造成弱標(biāo)記或無標(biāo)記現(xiàn)象。

然后通過文獻(xiàn)等查找一下目標(biāo)蛋白在該組織或細(xì)胞的表達(dá)豐度如何。若該蛋白本身表達(dá)就很少，那就沒啥可說的，你的結(jié)果應(yīng)該沒問題。

此外，如果抗體修復(fù)不充分，抗原表位未全暴露，也會出現(xiàn)弱標(biāo)記現(xiàn)象。比如，盡管大多數(shù)抗體都是在酸性環(huán)境中修復(fù)，但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)，建議查看抗體說明書，嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2、目標(biāo)蛋白的熒光太強(qiáng)，甚至形成非特異性的標(biāo)記，一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽性區(qū)域，造成假陽性結(jié)果

這種情況一般出現(xiàn)在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時(shí)候。多余的抗體會吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。

改進(jìn)方法是適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時(shí)間，一般能夠有所改善。

3、DAPI染細(xì)胞核時(shí)，加入的試劑太多，造成高背景染色

現(xiàn)在都是使用的防熒光衰減DAPI試劑，使用時(shí)滴上一滴就能將細(xì)胞核標(biāo)記。

但是這也帶來一個(gè)小問題。滴加的量太多時(shí)，會造成整張圖像呈現(xiàn)出藍(lán)色的背景。采集得到的圖像會很不好看，如果單純使用γ值曲線去調(diào)整，圖像中的細(xì)胞核會呈現(xiàn)出假假的感覺，像是P上去的。

因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。事實(shí)上，個(gè)人認(rèn)為只要切片沒有暴露在自然光或者激發(fā)光之下，熒光的自然衰減并沒有想象中那么快。

4、組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片，導(dǎo)致高背景染色

如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹di，也會造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹di，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。

實(shí)驗(yàn)過程中，玻片干燥了，同樣會造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個(gè)圈，可以有效改善。

5、采集圖像過程不當(dāng)，導(dǎo)致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析

采集圖像時(shí)不要對每一張圖像都加上標(biāo)尺，否則后期采用Image J或者IPP進(jìn)行分析時(shí)，這些標(biāo)尺會對結(jié)果造成影響。

采集圖像時(shí)，速度要快。如果激發(fā)光很長時(shí)間對準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會極快，有經(jīng)驗(yàn)的人都知道，不必多說。因此，目標(biāo)區(qū)域較小時(shí)，一定要盡量快速采集，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差。

采集圖像時(shí)，必須固定一個(gè)γ值，不可以在采集過程中修改。因?yàn)?，γ值確實(shí)可以改善圖像的某些瑕疵，但是這樣一來，圖像的熒光分布和強(qiáng)度會受到γ值的極大影響。調(diào)整幅度太大，更會造成熒光假假的感覺，非常失真。

當(dāng)然了，后期半定量分析時(shí)，如果一定要調(diào)整γ值，那也是對整批次圖像的統(tǒng)一調(diào)整，而不是某幾張圖像。千萬別走入造假的險(xiǎn)境之中。