WHO對HIV診斷試劑的評價
　 1998年，為向其成員國提供HIV實驗室診斷方面的建議，世界衛(wèi)生組織AIDS規(guī)劃署(GPA)啟動了評價商品化HIV抗體診斷試劑的計劃，目前也涵蓋了對抗原試劑及抗原／抗體試劑的評價。該計劃對一系列商業(yè)化診斷試劑的評價結(jié)果，為衛(wèi)生部門負(fù)責(zé)人有針對性地選擇診斷試劑提供了參考，同時也為診斷試劑的評價提供了標(biāo)準(zhǔn)。截至目前，所評價的試劑包括血清／血漿抗體檢測試劑、快速檢測(S／R)試劑、全血快速檢測試劑、尿液／唾液檢測試劑及抗原／抗體檢測試劑。自1998年GPA啟動商品化HIV診斷試劑評價計劃至今，已發(fā)布6份評價報告，評價的商業(yè)化試劑有63種之多，其中包括ELISA試劑、S／R試劑和WB試劑，檢測的樣本包括血清、血漿、全血、唾液和尿液等。

一、所評價的試劑以及所用的樣品

評價報告中所使用的試劑均為目前廣為應(yīng)用的商品化試劑，由商無償提供。不同的診斷試劑檢測樣本不同，針對診斷試劑檢測樣本的要求選擇相應(yīng)的評價樣品，主要包括血清／血漿樣本、全血樣本、唾液樣本和尿液樣本。

1．血清／血漿樣品的選擇

WHO評價過的檢測血清／血漿樣本的試劑有ELISA抗體試劑、S/R試劑和ELISA抗原／抗體試劑，不同原理的試劑在樣本選擇方面略有不同。

ELISA抗體試劑和S／R試劑在樣本選擇上基本相同，所用樣品主要由三部分組成：WHO血清盤、陽轉(zhuǎn)系列血清盤和HIV-1 O型血清，其中，HIV-1 O型血清不是必須選擇的。以WHO于1998對人類血清HIV抗體檢測試劑評價為例，ELISA抗體試劑和S／R試劑所用的樣品*相同。WHO血清盤包括595份血清樣品，分別來自不同地區(qū)，包含不同亞型，其陽性與陰性樣品比例約為1：2，具體如表17．4所示。8個陽轉(zhuǎn)系列血清盤購自美國BBI(Boston Biomedica Inc)公司，其編號分別為PRB 904、PRB909、PRB 911、PRB 912、PRB914、PRB 916、PRB 917和PRB 918，為8個不同患者不同時期的系列陽轉(zhuǎn)血清。6份HIV-l O型血清經(jīng)線性免疫分析試驗進(jìn)行確證，并用HIV-1 O型及M型特異性引物進(jìn)一步確認(rèn)。WHO血清盤及陽轉(zhuǎn)系列血清盤應(yīng)用于所有評價試劑，而HIV-1 0型血清僅用于評價能檢測HIV-1 O型的試劑盒。

ELISA抗原／抗體試劑的樣品選擇與上述兩者略有差別，在WH0血清盤及陽轉(zhuǎn)系列血清盤的選擇原則上，三者無明顯區(qū)別，除上述兩種評價樣品外，抗原／抗體試劑評價樣品還有操作血清盤，以2004年wHO對抗原／抗體試劑的評價報告為例，操作血清盤購自：BBI，包括一套由不同滴度抗HIV-1抗體血清組成的抗體血清盤和一套由不同滴度p24抗原血清組成的抗原血清盤，前者包括25份血清，后者包括19份血清，血清WB及抗原檢測結(jié)果由BBI提供。

2．全血樣品的選擇

全血試劑評價樣品包括三部分：WHO全血血樣品盤、其對應(yīng)的血清盤和BBI陽轉(zhuǎn)系列血清盤。以WHO 2000年對全血診斷試劑的評價為例，250份全血樣品收集于ED-TA抗凝管中，同時收集了與其對應(yīng)的血清樣品，250份樣品中，170份為抗HIV-1陰性，80份為陽性。8個陽轉(zhuǎn)系列血清盤購自美國BBI公司。

3．尿液及唾液樣品的選擇

尿液及唾液樣品包括兩部分：WH0尿液或唾液樣品盤及其對應(yīng)的血清樣品。因唾液及尿液試劑不能檢測血清樣品，因此選擇的樣品不包括BBI陽轉(zhuǎn)系列血清盤。以WHO 2002年對尿液及唾液診斷試劑評價為例，介紹樣品選擇及預(yù)處理。

1)尿液樣品：WHO共收集了300份尿液樣品及其對應(yīng)的血清樣品，其中，93份為HIV陽性，207份為HIV陰性。先將新鮮的尿液收集至無菌容器中，然后無菌分裝至聚丙烯螺口管中，不添加防腐劑，于2～8℃保存。所有樣品檢測前200g離心1min，然后轉(zhuǎn)移至無菌管中。所有血清樣品于一30℃凍存，凍融1或2次。

2)唾液樣品：WH0共收集了222份唾液樣品及其對應(yīng)的血清樣品，其中，75份為HIV陽性，147份為HIV陰性。根據(jù)不同唾液診斷試劑的要求對樣品進(jìn)行預(yù)處理。血清樣品保存方式與尿液對應(yīng)血清樣品相同。

二、實驗室操作以及參比試劑的選擇

所有檢測均嚴(yán)格按試劑說明書操作，通常評價一類試劑的所有實驗由一人操作完成，除WB以外的其他試劑，對一份樣品若*次檢測結(jié)果為陽性，則對該樣品重復(fù)檢測一次，若兩次結(jié)果不一致，再重復(fù)一次實驗，以三次檢測中兩次相同的結(jié)果作為該樣品檢測結(jié)果，若三次檢測結(jié)果各不相同，則將結(jié)果記為不確定。由于陽轉(zhuǎn)系列血清價格昂貴，對陽轉(zhuǎn)系列血清的檢測只進(jìn)行一次。對ELISA檢測結(jié)果將根據(jù)試劑要求用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。S／R及WB試劑檢測分別由三人獨立地判定結(jié)果，以結(jié)果相同的兩次作為zui終結(jié)果，若三人判定結(jié)果都不相同，則將結(jié)果記為不確定。

在待評價試劑檢測前，先用參比試劑對評價用樣品進(jìn)行檢測。在所有WHO HIV診斷試劑評價報告中，所用的參比試劑均為血清／血漿的檢測試劑。在血清／血漿樣品診斷試劑的評價中，參比試劑的檢測樣品與待評價試劑的相同；而在其他類型樣品(全血、尿液、唾液等)的診斷試劑評價中，參比試劑的檢測樣品為其他類型樣品所對應(yīng)的血清／血漿樣品。

參比試劑包括兩種類型：初篩試劑和確證試劑。初篩試劑一般為ELISA診斷試劑，至少應(yīng)包括兩種試劑(有時用確證試劑替代，如對HIV-2陽性樣品的檢測)；確證試劑一般為WB試劑和(或)LIA試劑，對于HIV-1陽性樣品一般只需一種確證試劑，而對于HIV-2陽性樣品則需三種確證試劑，來區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染。

以S／R診斷試劑評價為例。S／R試劑檢測樣品對應(yīng)的血清／血漿中，所有HIV陰性及HIV-1陽性樣品先經(jīng)兩種ELISA診斷試劑篩查，兩種診斷試劑為VironostikaHIV Uni-Form II plus O(Organon Teknika)和the Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Be-hringwerke AG)，兩種試劑檢測均為陰性，則認(rèn)為其為陰性，若任一試劑檢測為陽性，則用相同試劑雙份復(fù)試，若任一試劑或兩試劑重復(fù)仍為陽性，則用免疫印跡試驗進(jìn)行確證，確證試劑為InnoLIA HIV(Innlgenetics)。對于HIV-2陽性樣品，為了區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染，先用兩種wB試劑對其進(jìn)行檢測，兩種試劑為West-ern Blot HIV-1(WB HIV-1)[GenelabsDiagnostics，HIV Blot，(version 1．2)]和NEWLAV BLOT II(WB HIV-2)(SanofiDiagnostics Pasteur)，若兩種檢測試劑均為陽性或結(jié)果不確定，則再用Pepti-Lav 1+2(Sanofi Diagnostics Pasteur)進(jìn)行確證。若WB結(jié)果中出現(xiàn)兩條env條帶，無論有無gag、pol條帶，結(jié)果都為陽性；若WB結(jié)果中無任何條帶為陰性；其他檢測結(jié)果為不確定。參比試劑檢測不確定的樣品，在試劑評價中不予應(yīng)用。

三、評價的技術(shù)指標(biāo)

WHO HIV體外診斷試劑的評價指標(biāo)有靈敏度、特異性、陽性預(yù)期值、陰性預(yù)期值、可信限、δ值、重復(fù)性，前文已做了詳細(xì)介紹，不再贅述，僅就其特殊的評價指標(biāo)做簡要介紹，包括陽轉(zhuǎn)系列血清相對敏感性系數(shù)、操作血清檢測靈敏度、結(jié)果判定變異度。

1．陽轉(zhuǎn)系列血清相對敏感性系數(shù)

除尿液及唾液檢測試劑外，其他試劑都對BBI陽轉(zhuǎn)系列血清進(jìn)行了檢測，以參比試劑對陽轉(zhuǎn)系列血清檢測結(jié)果作為對照，WH0選擇Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Behringwerke AG)作為參比試劑，對每一陽轉(zhuǎn)血清盤，Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus檢出的*份系列血清定為0，將待評價試劑檢測結(jié)果與其作對比，確定待評價試劑檢出的*份系列血清與參比試劑的0血清的位置關(guān)系。對任一陽轉(zhuǎn)血清盤而言，若待評價試劑檢測出*份為陽性的樣品的位置在參比試劑的O血清位置前2位，則該待評價試劑檢測該轉(zhuǎn)血清盤的相對敏感性系數(shù)為一2。反之，若在參比試劑的0血清位置后3位，則相對敏感性性系為+3。如此類推，對全部陽轉(zhuǎn)血清盤而言，待評價試劑的陽轉(zhuǎn)血清相對敏感性系數(shù)為所有單獨的相對敏感性系數(shù)的均值，并計算95％可信限，以此來評價試劑對窗口期樣品的檢測能力，數(shù)值越小，試劑越靈敏。

2．操作血清檢測靈敏度

為評價HIV Ag／Ab試劑對不同滴度抗原及抗體血清的檢測能力，在HIV Ag／Ab試劑評價中引入了操作血清盤檢測。操作血清盤有兩種：抗體操作血清盤和抗原操作血清盤，分別由不同滴度抗體和p24抗原的血清組成。用待評價Ag／Ab試劑分別檢測抗體及抗原操作血清盤，檢測結(jié)果與。BBI提供的抗體wB及抗原試劑檢測結(jié)果做比較，得出待評價試劑檢測操作血清盤的靈敏度。

3．結(jié)果判定變異度

當(dāng)試劑檢測結(jié)果不是由儀器而是由操作者人為讀取時，不同操作者讀取的結(jié)果可能存在差異。如WB及S／R試劑檢測結(jié)果的讀取，此情況下，結(jié)果的讀取通常由三人獨立完成，zui終結(jié)果為兩人判斷相同的結(jié)果，若三人結(jié)果都不同，則結(jié)果為不確定。結(jié)果判定變異度為結(jié)果判定不一致的血清占總血清數(shù)的百分比：結(jié)果判定變異度=結(jié)果判斷不一致血清/總血清數(shù)100％

4．附加分析

除上述評價指標(biāo)外，WHO還制定了一套評分系統(tǒng)，由實驗操作者對試劑滿意度、試劑的操作簡便性、應(yīng)用于小實驗室的可行性等進(jìn)行評估。

四、WHO評價試劑的具體內(nèi)容

WHO對HIV診斷試劑的評價結(jié)果以圖表的形式列出，主要包括以下幾方面的內(nèi)容：①試劑的一般特性；②待評價試劑與參比試劑結(jié)果比較；③操作方面的特點；④試劑應(yīng)用的簡便性及應(yīng)用于小實驗室的可行性；⑤陽轉(zhuǎn)系列血清檢測結(jié)果比較；⑥操作血清盤檢測結(jié)果比較(HIV Ag／Ab試劑)。

1．試劑的一般特性

試劑的一般特性包括以下幾個方面：①試劑商及產(chǎn)地；②試劑類型，按試劑原理分類，如雙抗原夾心ELISA、免疫層析試劑；③試劑、原料，如包被抗原或抗體類型，是重組抗原還是合成抗原，是HIV哪一段的抗原，是單克隆抗體還是多克隆抗體，針對HIV哪一段抗原的抗體；④固相支持物的類型，如ELISA 試劑一般為12×8的微孔板條；⑤檢測樣本的類型為血清／血漿、全血、尿液或唾液等；⑥每個試劑盒所包含的反應(yīng)數(shù)；⑦批號及失效日期；⑧儲存時間及條件；⑨每一反應(yīng)所需樣本量；⑩檢測一次所需時間及處理的樣品量；⑨結(jié)果讀取方式，如wB試劑為肉眼讀取，ELISA為分光光度計讀取并注明波長；⑥每人份的市場指導(dǎo)價。

2．待評價試劑與參比試劑結(jié)果比較

即以參比試劑檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)來評價待評價試劑，其評價指標(biāo)包括以下幾方面：①靈敏度及靈敏度95％可信限；②特異性及特異性95％可信限；③不確定結(jié)果百分率；④結(jié)果判定變異度；⑤陽性預(yù)期值；⑥陰性預(yù)期值。

3．試劑盒操作方面的特點

主要包括以下幾方面：①試劑盒的大小(寬-長-高)；②儲存條件；③反應(yīng)條件；④反應(yīng)終止后的穩(wěn)定性；⑤試劑盒中各組分開封后的穩(wěn)定性及儲存條件，如ELISA試劑盒中的微孔板條、陰陽性對照、樣品稀釋液、酶結(jié)合物等；⑥每次實驗每一試劑盒所能檢測的zui大和zui小樣品數(shù)；⑦每次檢測中所需的對照及其數(shù)量；⑧每次檢測所需時間；⑨試劑盒未提供但檢測所需的儀器設(shè)備；⑩結(jié)果判斷法則，包括cut-off值計算公式；⑥灰區(qū)或無效結(jié)果的判定。

4．操作者對試劑盒的總體評價

WHO制定了一套評分系統(tǒng)，由實驗操作人員對試劑盒做出總體評價，主要包括以下幾方面：①試劑盒操作步驟，1～2步為6分，3～5步為3分，>5步為1分；②試劑盒說明書情況，“好”為2分，“需改進(jìn)”為1分；③試劑盒及其組分的包裝及標(biāo)簽，“好”為2分，“需改進(jìn)”為1分；④總分，上述三項分?jǐn)?shù)之和；⑤操作者對試劑盒的建議。評分越高，操作者對試劑盒的評價越高。

5．操作簡便性分析  

WHO對試劑盒操作的簡便性分析也制定了一套評分系統(tǒng)，以ELISA HIV Ag／Ab試劑為例，主要包括以下幾方面：①實驗中需操作者準(zhǔn)備的試劑、酶標(biāo)板條、底物、洗液、酶標(biāo)抗原、稀釋血清，不需準(zhǔn)備為1分，需準(zhǔn)備為0分；②試劑盒中組分開封或稀釋后的穩(wěn)定性，標(biāo)明開封或稀釋后有效期的為1分，開封或稀釋后不穩(wěn)定的為0分，試劑盒中的每一組分作為一項，如酶標(biāo)版條、樣品稀釋液、陰陽性對照等；③試劑盒未提供但檢測中需要的設(shè)備或試劑，如加樣排槍、樣品稀釋管、終止液等，不需準(zhǔn)備為1分，需要準(zhǔn)備為0分；④操作者對試劑盒總體評價的總分；⑤總分，上述4項得分的綜合；⑥結(jié)論，<20分為不簡便，≥20分而≤25分為簡便，>25分為非常簡便。

6．應(yīng)用于小實驗室的可行性

WH0制定了一套評分系統(tǒng)來評價試劑是否適用于小實驗室，主要包括以下幾方面：①敏感性，100％為5分，98％～100％為3分，<98%為0分；②特異性，>98％為5分，95％～98％為3分，<95％為O分；③反應(yīng)溫度，室溫反應(yīng)為3分，非室溫反應(yīng)為1分；④效期，>1年為5分，6個月～1年為2分，<6個月為1分；⑤每人份價格，≤1美元為3分，>1美元而≤2美元為2分，>2美元為1分；⑥操作簡便性，非常簡便為5分，簡便為3分，不簡便為1分；⑦檢測每人份的操作時間，<10min為3分，10～30min為2分，>30min為1分；⑧是否需要洗板機(jī)或攪拌器，不需要為3分，需要為1分；⑨結(jié)果判定，若為肉眼讀取：結(jié)果判定變異度≤3％為5分，結(jié)果判定變異度>3％為3分，若為機(jī)器讀取為1分；⑩總分，為以上9項得分之和；⑩結(jié)論，得分<23為不適用，得分≥23而≤30為適用，得分>30為非常適用。

7．陽轉(zhuǎn)系列血清檢測結(jié)果

將每種待評價試劑對每個血清盤中的每一份系列血清檢測結(jié)果列于表中，同時表中列出參比試劑檢測結(jié)果，將兩結(jié)果做比較，計算出陽轉(zhuǎn)血清相對敏感性系數(shù)(詳見453頁)，并計算每一試劑檢測所有系列血清所得的相對敏感性系數(shù)均值和95％可信限。

8．HIV-1 O型血清盤檢測結(jié)果

若待評價試劑能檢出HIV-l O型樣品，可用HIV-1 O型血清盤對其進(jìn)行評價，將檢測結(jié)果及確證試劑檢測結(jié)果作對比，來評價試劑對HIV-1 O型樣品的檢測能力。

9．操作血清盤檢測結(jié)果

對于HIV-1 Ag／Ab檢測試劑，還需用由不同滴度抗原和抗體血清組成的操作血清盤對其進(jìn)行評價，將檢測結(jié)果與BBI提供的結(jié)果做比較，來評價試劑對不同滴度樣品的檢測能力。

近年來，隨著對HIV研究的不斷深入和實驗室診斷技術(shù)不斷發(fā)展，HIV診斷試劑研究工作取得了長足進(jìn)展，大量新技術(shù)、新試劑不斷涌現(xiàn)。WHO對商品化診斷試劑的評價，不僅提供了許多常規(guī)評價指標(biāo)，如敏感度、特異性等，還對試劑操作簡便性、應(yīng)用于小實驗室的可行性等進(jìn)行了評估，為醫(yī)療衛(wèi)生部門選擇試劑提供了依據(jù)，也為診斷試劑的評價提供了很好的參考。