ELISA試劑盒中用以分離結(jié)合標記物和游離標記物

1．抗原  
在ELISA試劑盒中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高，特異性不強；合成抗原一般為多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)表位，親和力不高，可能導(dǎo)致相應(yīng)表位的抗體漏檢；基因重組抗原具有安全、特異性強、親和力高、產(chǎn)量大等特點，是一種比較理想的抗原，但其純化比較困難。 

2．抗體  
在ELISA試劑盒中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復(fù)雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術(shù)成熟，產(chǎn)量大，批間差異小，但結(jié)合位點的單一也正是其弱點之所在，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結(jié)合位點的缺乏，容易造成假陰．性結(jié)果。在使用雙單抗一步法時，應(yīng)注意抗原過剩時的“鉤狀效應(yīng)”
 3．酶和底物  
   在ELISA試劑盒中zui常用的酶為HRP和ALP。
    （1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素） 結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為五色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，是酶的活性基團，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3．0。HRP質(zhì)量的另一重要指標是酶活力，以單位（unit，U）表示。用于標記的HRP比活性應(yīng)≥250U／mg。HRP的作用底物為H202，催化下列反應(yīng)；
DH2+H202  HRP  D+2H2O
   上式中DH2為供氫體（即底物），H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種，在ELISA中常用的有：鄰苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS]。三者各有優(yōu)缺點：OPD是在ELISA中應(yīng)用zui多的底物，靈敏度高，比色方便，但配成溶液后穩(wěn)定性差，且有致異變性；TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍色，加酸終止反應(yīng)后顯黃色，目測對比鮮明，可比色定量，溶液的穩(wěn)定性也較差，但無致異變性，因此應(yīng)用日見增多；ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
    （2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U／mg以上。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽（PNP），降解產(chǎn)物為黃色的對硝基酚。經(jīng)NaOH終止酶反應(yīng)后，顏色維持比較穩(wěn)定。
在ELISA試劑盒中酶作用于底物后生成有色物質(zhì)、熒光物質(zhì)或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光，分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量。熒光和化學(xué)發(fā)光測定的敏感度均高于比色測定，標準曲線的線性范圍亦較比色反應(yīng)寬，測定效果優(yōu)于常用的比色ELISA試劑盒。