elisa酶聯(lián)免疫試劑盒1.1.1 菌株與質(zhì)粒
Escherichia coli DH5α 和 BL21 (DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。E. coli DH5α 為基因克隆，E. coli BL21 (DE3) 為發(fā)酵培養(yǎng)菌株。 pCOLADuet-1 購(gòu)自 Novagen 公司，pTrcHis2B 購(gòu)自 Invitrogen 公司。pTrc-low、pACYCDuet-mvaE-mvaS 為本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建好質(zhì)粒，其中 pTrc-low 是以 pTrcHis2B 為載體，攜帶了來(lái)源于釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 的 PMD、MK、PMK 和 IPI 四種酶的基因；pACYCDuet-mvaE-mvaS 是以 pACYCDuet-1 為載體，攜帶糞腸球菌 Enterococcus faecalis 的 mvaS 和 mvaE 兩種酶的基因。基因 gpps、ls 和 p450 經(jīng)過(guò)大腸桿菌表達(dá)宿主序列優(yōu)化后，由金唯智公司合成，并連接到載體 pUC57 上。
1.1.2 培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基：10.0 g/L 蛋白胨、5.0 g/L 酵母粉、 10.0 g/L NaCl，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。紫蘇醇的發(fā)酵培養(yǎng)基是在 LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為 2 mmol/L 的 MgSO4。根據(jù)質(zhì)粒抗性需要添加相應(yīng)抗生素，培養(yǎng)基中抗生素終濃度為：Kan 50 μg/mL， Amp 100 μg/mL，抗生素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。
1.1.3 試劑及儀器
基因組 DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒和 DNA 純化試劑盒購(gòu)自 Omega 公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase 購(gòu)自 TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自 Thermo scientific 公司；DNA Marker 等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成和基因測(cè)序是由青島擎科生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的主要儀器包括：Bio-Rad PCR 儀、 Bio-Rad 凝膠成像儀、Bio-Rad 電泳儀、Varian GC450 氣相色譜、Varian Cary50 分光光度計(jì)。
1.2 基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建
質(zhì)粒 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、限制性酶切、連接等均按說(shuō)明書(shū)和常規(guī)方法進(jìn)行。本研究質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物見(jiàn)表 1。培養(yǎng)攜帶 pUC57-p450 和 pUC57-ls 的載體菌株，提取質(zhì)粒。再分別以質(zhì)粒 pACYCDuet-mvaE-mvaS 和 pUC57-gpps 為模板，采用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 擴(kuò)增基因 mvaE-mvaS、gpps。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳分析后，回收 PCR 目的片段，將回收產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用 DNA 純化試劑盒回收，再連接到經(jīng)同樣酶切并回收的質(zhì)粒載體 pCOLADuet-1 上，獲得重組質(zhì)粒。感受態(tài)細(xì)胞采用 Competent Cell Preparation Kit 試劑盒 (TaKaRa 公司) 進(jìn)行制備。
1.3 重組菌的發(fā)酵及發(fā)酵條件的優(yōu)化
1.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化
誘導(dǎo) OD 值對(duì)合成紫蘇醇的影響：重組質(zhì)粒 pCOLA-gpps-mva-ls-p450 和 pTrc-low 轉(zhuǎn)化到 E. coli BL21 (DE3) 中獲得合成紫蘇醇的重組大腸桿菌。挑取平板上的單菌落，接種于 4 mL (加入適量的 Amp 和 Kan) 的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 8 h。將 500 µL 上述種子液接種于 50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基 (含 Amp 和 Kan) 中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。分別在菌液 OD600 達(dá)到 0.3、0.6、0.8、 1.0 和 1.5 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑 IPTG 誘導(dǎo)，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。發(fā)酵 36 h 后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。