細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備： 1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。 中文名稱：AO-EB雙染色試劑盒 英文名稱：Acridine Orange(AO)/EB Double Stain Kit 產(chǎn)品規(guī)格：50ml*2|250ml*2 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6539 橙能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，與雙鏈DNA結合后發(fā)出綠色熒光，溴化乙錠(EB)僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。二者很容易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細胞形態(tài)：活細胞(VN)，核染色質著綠色并呈正常結構；早期凋亡細胞(VA)，核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細胞(NVA)，核染色質為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細胞(NVN)，核染色質著橘紅色并呈正常結構。本產(chǎn)品AO、EB 溶液濃度分別為100ug/ml，所含穩(wěn)定劑不影響實驗效果。 使用方法：（僅供參考） 1、使用前先根據(jù)用量，將AO溶液和EB溶液按1:1混合成工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。 2.1、對于貼壁細胞或爬片，去掉培養(yǎng)基，用 PBS 洗兩遍去除殘余培養(yǎng)基和未貼壁細胞，加入新的 PBS；如果需要觀察全部細胞特性，保留未貼壁細胞，可以直接在培養(yǎng)基中加入工作液。按照每毫升培養(yǎng)基或 PBS 中加入 20ul 工作液即可。室溫放置 2-5min 后，用 PBS 洗 2 次，除去殘余的熒光染料。加入新的 PBS 或培養(yǎng)基于熒光顯微鏡下觀察即可。 2.2、對于懸浮細胞，可直接加入工作液或離心收集細胞后在 PBS 中加入工作液。按照每毫升培養(yǎng)基或 PBS 中加入 20ul 工作液即可。室溫放置 2-5min 后，離心去除工作液，后用 PBS 洗 2 次，除去殘余的熒光染料。加入新的 PBS 或培養(yǎng)基于熒光顯微鏡下觀察即可。 3、建議用藍光激發(fā)，視野下可以觀察到死細胞呈現(xiàn)紅色，活細胞呈現(xiàn)綠色。 保存：4℃避光密封保存，有效期一年。 |
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。 操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus（SlNPV）斜紋夜蛾核型多角體病毒LAMP試劑盒 種源性檢測 50次 低溫 負20度 一年 3-4周 Streptococcus iniae海豚鏈球LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Histophilus somni睡眠嗜組織探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 螺源性成分LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Ureaplasma urealyticum解脲支原體探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用） 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Rhizoma dioscoreae山藥LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Radix ephedrae麻黃根PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Rabies Virus(RV、street virus)狂犬病病毒街毒株探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Radix gentianae macrophyllae秦艽LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Radix ephedrae麻黃根染料法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Trichophyton mentagrophytes須毛癬LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Herba moslae香薷探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 AO-EB雙染色試劑盒人磷脂A2(PL-A2)免疫試劑盒*直銷 OGY瓊脂 英文名稱：OGY Agar 產(chǎn)品規(guī)格：250g 人基質金屬蛋白抑制因子2(TIMP-2)免疫試劑盒進口、組裝 瓊脂培養(yǎng)基J 英文名稱：Agar medium J (Deoxycholate citrate agar) 產(chǎn)品規(guī)格：250g 人成纖維細胞生長因子23(FGF-23)免疫試劑盒進口、分裝 香素 ： 91-64-5 規(guī)格： HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 人CD44分子(CD44)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應 小鼠組織蛋白去乙?；?/span>2(Hdac2/Yy1bp)免疫試劑盒*直銷 牛內皮型一氧化氮合成(eNOS)免疫試劑盒進口、分裝 小鼠抗胰蛋白(AT)免疫試劑盒進口、組裝 雞白介素10(IL-10)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應
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