操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：EGFR和ErbB2抑制劑(AST-1306 TsOH)

英文名稱：AST-1306 TsOH

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8042

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

人 RAN 基因全長ORF克隆人乙基丙二酸免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 RAB11A 基因全長ORF克隆人乙肝表面抗原大蛋白(HBV-LP)免疫試劑盒*直銷

人 RAB5A 基因全長ORF克隆人乙醇脫氫(ADH)免疫試劑盒進口、組裝

人 EBAG9 基因全長ORF克隆人乙胺碘呋酮(AD)免疫試劑盒進口、分裝

人 RAB39B 基因全長ORF克隆人胰脂肪(PL)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 RGS2 基因全長ORF克隆人胰抑制素(Pancreastatin)免疫試劑盒*直銷

人 GLTP 基因全長ORF克隆人胰腺癌標志物CA242 免疫試劑盒進口、組裝

人 COMMD10 基因全長ORF克隆人胰高血糖素樣肽2受體(GLP2R)免疫試劑盒進口、分裝

人 RERG 基因全長ORF克隆人胰高血糖素樣肽2(GLP2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 CSRP3 基因全長ORF克隆人胰高血糖素樣肽1受體(GLP1R)免疫試劑盒*直銷

人 MID1IP1 基因全長ORF克隆人胰高血糖素樣肽1(GLP-1)免疫試劑盒進口、組裝

EGFR和ErbB2抑制劑(AST-1306 TsOH)CYP3A4誘導(dǎo)抑制劑(Isosilybin)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg  Isosilybin1.5mL 綠如藍核酸染料（UV） DNAGREEN 4℃保存

CCR1激動劑(NSC5844)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg  NSC58442 ug pGEM 5ZF（+） pGEM 5ZF（+） 低溫運輸，-20℃保存

Nek2/Hec1抑制劑(INH6)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  INH6抗生素檢定培養(yǎng)基5號 Antibiotic No.5（PH8.0) 250g

PKR激活劑(PKR-IN-2)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  PKR-IN-21瓶 DU-145細胞株 DU-145 低溫運輸和保存

PI3Kδ抑制劑（TGR-1202 R-enantiomer）  1mL(10mM)|2mg|5mg  TGR-1202 R-enantiomerSDC(TSA W/TTC)平板  9cm*10個

HMG-CoA還原酶抑制劑（Fluvastatin sodium）  1mL(10mM)|50mg|100mg  Fluvastatin sodium1瓶 AE-2細胞株 AE-2 低溫運輸和保存

PDE3A抑制劑(Cilostazol)  1mL(10mM)|50mg|100mg  Cilostazol100mL POPSO Buffer，0.2M,pH8.5   POPSO Buffer，0.2M,pH8.5   常溫保存

guanylate cyclase激活劑（Cinaciguat）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg  Cinaciguat1mL 環(huán)A溶液,10mg/mL Cyclosporin A Solution -20℃避光保存

心臟晚期鈉電流抑制劑(GS967)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  GS9672 ug pPRIME-TREX-GFP-FF3 pPRIME-TREX-GFP-FF3 低溫運輸，-20℃保存

PDE5抑制劑（Sildenafil citrate）  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Sildenafil citrate蛋白胨水（肉湯）  20支

HIF-PH抑制劑(Molidustat)  2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Molidustat2 ug pCAMBIA1305.2 pCAMBIA1305.2 低溫運輸，-20℃保存