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產(chǎn)品展示
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細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)
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產(chǎn)品型號(hào):
產(chǎn)品報(bào)價(jià):
產(chǎn)品特點(diǎn):
細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)公司正在出售的產(chǎn)品:0.156-10 ng/mL 人腎損傷分子1(Kim-1)ELISA試劑盒 31.2-2000 pg/mL ELISA Kit for Human Succinate-semialdehyde dehydrogenase, mitochondrial 31.2-2000 pg/mL 人催乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)ELISA試劑盒 1
  細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)的詳細(xì)資料:

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明:

1.本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng),而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮細(xì)胞可使用滴片法;

2.所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃,并經(jīng)過鉻酸洗液處理;

3.蓋玻片非常薄,易碎,取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕;

4.如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞,可以使用較大的培養(yǎng)皿,但不宜過大,以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率;

5.如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差,可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn):

1)將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱;準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管,加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2)將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫(可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中)。輕輕晃動(dòng)凍存管,使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍,使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3)用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi),將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi),輕輕吹打液體,使細(xì)胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4)800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,吹打制成細(xì)胞懸液。

5)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi),補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6)第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況,換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代,細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品參數(shù):

中文名稱

英文名稱

產(chǎn)品規(guī)格

產(chǎn)品貨號(hào)

細(xì)胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒(柱式吸附)

DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column

50次

BJ-01X6324

商品詳細(xì)介紹:

本試劑盒是目前先進(jìn)的DNA Ladder抽提試劑盒之一。本試劑盒是針對(duì)細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的核小體間DNA鏈斷裂而設(shè)計(jì)的??梢苑浅S行У爻樘嵝∑螢?80-200bp的DNA ladder,同時(shí)又可以抽提到大50kb左右的基因組DNA。本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品。

DNA ladder也稱DNA fragmentation,是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。通常觀察到DNA ladder,就可以判定細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

樣品首先被蛋白酶K消化,隨后加入適合DNA結(jié)合到純化柱上的緩沖液,然后加入到純化柱內(nèi)。通過高速離心,使DNA在穿過純化柱的瞬間,結(jié)合到純化柱上,隨后通過兩次洗滌去除各種雜質(zhì),后通過洗脫液把DNA洗脫下來(lái)。整個(gè)過程無(wú)需酚抽提,無(wú)需酒精沉淀,樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。

通過DNA純化柱方式抽提DNA ladder比用傳統(tǒng)的酚抽提酒精沉淀方法更加便捷,小片段DNA不容易損失。試劑盒提供了RNase A,可以獲得不含RNA的高純度總DNA,排除了RNA對(duì)DNA ladder觀察造成的干擾。

本試劑盒每次多可以抽提20mg組織或200-350萬(wàn)個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞。樣品用量過多,反而會(huì)影響抽提效果。純化柱對(duì)于DNA的大容量約為30微克。通常每200萬(wàn)Hela細(xì)胞或500萬(wàn)淋巴細(xì)胞可以抽提得到15-25微克總DNA,每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA,每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA,每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA。樣品的用量請(qǐng)勿超過純化柱的容量,樣品用量好能保持在純化柱容量的70%或以下。當(dāng)然過少的樣品也不利于檢測(cè)到DNA ladder。

對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡檢測(cè),通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞就足夠用于DNA ladder的抽提和檢測(cè)。

試劑盒組份:

樣品裂解液A——————10ml

樣品裂解液B——————11ml

洗滌液I——————21ml(第一次使用前加入7ml無(wú)水乙醇)

洗滌液II——————16ml (第一次使用前加入24ml無(wú)水乙醇)

洗脫液——————22ml

蛋白酶K——————1.1ml

RNase A——————220μl

DNA純化柱及廢液收集管——————50套

儲(chǔ)存條件:室溫,有效期一年。( 蛋白酶K需-20℃保存)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告:

一、分離與培養(yǎng):

1、無(wú)菌條件下,取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,然后用PBS將此組織塊清洗2次,最后將組織剪成1mm3左右大??;

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型膠原酶),混懸10s,置37℃條件下消化10min,之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置;

3、剩下的組織再加入3~4mL酶消化液,混懸10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,重復(fù)此步驟2-3次,直至組織*被消化;

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液,1200r/min 離心10min,棄去上清,沉淀細(xì)胞用含有10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,接種于25cm2培養(yǎng)瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

5、差速貼壁1h后,吸出培養(yǎng)基,按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng);

二、免疫熒光鑒定:

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),棄去培養(yǎng)基,用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min;

2、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在4℃條件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;

3、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在室溫條件下,用4% BSA封閉細(xì)胞30min;

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗,然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜;

5、PBS沖洗細(xì)胞3次,每次10min,按1:150的比例稀釋抗α-actin的二抗, 37℃條件下放置1h;

6、用PBS沖洗3次,每次10min,最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

培養(yǎng)操作步驟

1.用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出,用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈,不要用紗布;

2.將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板(每孔一片)或培養(yǎng)皿中(每個(gè)平皿可放置2-3片);

3.在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí);

4.將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中,使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中;

5.將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí),將培養(yǎng)板取出,用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片,用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。 
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