培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細(xì)介紹：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

人 KIM-1 / TIM1 / HAVCR1 基因全長ORF克隆人γ谷-半胱合成(γ-GCS)免疫試劑盒*直銷

人 ACTN2 基因全長ORF克隆人γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16/p16(IFI16/p16)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ACTN4 基因全長ORF克隆人γ干擾素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子(MIG/CXCL9)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 Integrin beta2 基因全長ORF克隆人γ干擾素受體(IFN-γR)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 Serum Albumin / HSA / ALB 基因全長ORF克隆人γ干擾素(IFN-γ)抗體免疫試劑盒*直銷

人 IGFBP4 基因全長ORF克隆人γ干擾素(IFN-γ)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ACO1 / IREB1 基因全長ORF克隆人γ分泌素激活蛋白(PION)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 NAT1 基因全長ORF克隆人γ分泌免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 AAMP 基因全長ORF克隆人γ氨基丁酸(GABA)免疫試劑盒*直銷

人 ACTL6A 基因全長ORF克隆人β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白(BTRC)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ACTB 基因全長ORF克隆人β抑制蛋白2(ARRB2)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

PD-1抑制劑(Nivolumab)暗盒(8×10)  8*10  2 ug PT2/RMCE-puDTK PT2/RMCE-puDTK 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

WB化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒(人IgG)  1kit  ECL Western Blotting Detection Kit(Human IgG)李氏菌增菌肉湯(LB1,LB2)基礎(chǔ) Listeria Enrichment Broth Base 250g

10%SDS溶液  100ml|500ml  SDS Solution,10%5u 氧化 Xanthine Oxidase 4℃保存

50×Denhardts溶液  50ml  Denhardts solution,50×50T 轉(zhuǎn)基因植物TETR基因PCR檢測試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

Western洗滌液  100ml|500ml  50 T 肽一還原測試盒 Oxidative Stress Detection Kit 常溫保存

Western抗體洗脫液(酸性)  100ml  250mL Maleate Buffer（馬來酸緩沖液）,0.2M,pH6.5  Maleate Buffer,0.2M,pH6.5  常溫保存

Western抗體洗脫液(堿性)  100ml|500ml  25OD G(5′)ppp(5′)G 帽結(jié)構(gòu)類似物 RNA Cap Structure Analogs -20℃保存

Western抗體洗脫液(強(qiáng)堿性)  100ml|500ml  2 ug pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

封閉用脫脂奶粉  25g|50g  改良GAM瓊脂 GAM Agar,Modified 250g

Western封閉液(尼龍膜)  100ml  2 ug pKD3 pKD3 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

Western封閉液  100ml  匹克氏肉湯基礎(chǔ)A Pick’s Broth BaseA 100g