運(yùn)輸和保存: 視天氣狀況和運(yùn)輸距離遠(yuǎn)近,公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進(jìn)行。 1)1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中,置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進(jìn)行運(yùn)輸;收到細(xì)胞后請盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),如無法立刻進(jìn)行復(fù)蘇操作,凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個月。 2)T-25培養(yǎng)瓶充滿*培養(yǎng)基后進(jìn)行常溫運(yùn)輸;收到細(xì)胞后請鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài),如鋪瓶率超過85%請立即進(jìn)行傳代操作,如懸浮的細(xì)胞較多,請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁。 產(chǎn)品名稱 | 大鼠小腸粘膜上皮細(xì)胞 | 英文名稱 | The rat intestinal mucosa epithelial cells | 規(guī)格 | 5×105cells |
培養(yǎng): 1.取出小鼠后瀝干酒精,放入超凈臺內(nèi),固定在泡沫板上。 2.用鑷子提起皮膚,用解剖剪剪開皮膚一個橫切口,將皮膚向上撕開,然后剪開肌肉等,暴露出腹腔,在左側(cè)找到脾臟,用彎頭眼科鑷取出脾臟,置于無菌培養(yǎng)皿中。 3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,并剔除多余無用的組織。 4.將篩網(wǎng)置于平皿中,脾臟置于篩網(wǎng)上,用彎頭鑷鑷住,輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨,同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。 5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中,離心(1000rpm,5min),吸去上清(去除血液等)。 6.加入10ml培養(yǎng)液,吹打混勻,取樣計數(shù)。 7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中,輕輕搖晃混勻,在培養(yǎng)瓶上。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程: 一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備: 1)準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,貨號21875-091),90%;胎牛血清,10%。 2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配,液氮儲存。 二.細(xì)胞處理: 1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖晃解凍,移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。 2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 對于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法: 方法一:收集細(xì)胞,1000RPM,常溫條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。 操作流程: 1.1主要試劑與儀器:倒置相差顯微鏡(日本 olympus imt-413),co2孵箱(日本yamato it-61)。 1.2 hek-293細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)傳代及凍存: 1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管,立即投入37℃水浴,并不斷的搖動,使之迅速融化。 將溶解的細(xì)胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細(xì)胞的凍存液,加入事先裝好培養(yǎng)液(37℃預(yù)熱,8~10倍體積)離心管內(nèi),稍微吹打混勻,然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量培養(yǎng)液,吹打成細(xì)胞懸液, 以1×105/ml密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),在37℃、5%co2及飽和濕度下培養(yǎng)。 1.2.2 細(xì)胞傳代 原代培養(yǎng)的hek-293細(xì)胞48h換液1次,細(xì)胞長至60%~70%融合時,用0.25%胰酶消化1~2min,將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細(xì)胞脫壁、懸浮、分散,為使細(xì)胞進(jìn)一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次,獲得細(xì)胞懸液,然后加入倍量的培養(yǎng)基,溫和混勻,吸管分裝混合液,傳代擴(kuò)增細(xì)胞。 1.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的生長情況及形態(tài)特征。 1.4 細(xì)胞的計數(shù) 常規(guī)消化細(xì)胞,待細(xì)胞變圓、脫壁并浮起,加入少量培養(yǎng)基離心,再用pbs重懸并吹打制成細(xì)胞懸液。在細(xì)胞計數(shù)板蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液,用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格細(xì)胞數(shù),按公式計算出細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml原液=(四方格細(xì)胞數(shù)之和/4) ×104。 1.5 細(xì)胞的貼壁率 指數(shù)生長期的細(xì)胞,以0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液,計數(shù)后分別接種于12個25cm2培養(yǎng)瓶中,每兩小時隨機(jī)取出3瓶細(xì)胞,吸除培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞,加入胰消化酶消化、計數(shù)已貼壁細(xì)胞,取其平均值,按照公式:貼壁率(%)=(已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) =計算貼壁率。 1.6 生長曲線 取指數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,以1×104/孔接種于24孔板,每孔加入1ml培養(yǎng)基。每天隨機(jī)取3孔,計數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)目并計算平均值。連續(xù)計數(shù)10d,繪制細(xì)胞生長曲線。 兔心肌鈣黏蛋白(H-Cadherin)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔細(xì)胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔端錨聚合酶2 (TNKS2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔低密度脂蛋白受體(LDLR)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔甘露糖受體C2 (MRC2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔結(jié)蛋白(Des)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔激活素A(ACVA)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔黏著斑激酶(FAK)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔羧肽酶E(CPE)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 兔尿微量白蛋白(MAU)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 大鼠小腸粘膜上皮細(xì)胞RPLP2 酸性核糖體磷蛋白P2抗體 規(guī)格: 0.2ml FRA1/FOSL1 FRA-1蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml NMDAR2B 谷氨酸受體2B抗體 規(guī)格: 0.1ml TNF alpha 瘤壞死因子-α/TNFα抗體 規(guī)格: 0.1ml Phospho-eNOS(Ser1177) 磷酸化氮合成酶3抗體(內(nèi)皮型) 規(guī)格: 0.1ml PIH1D1/*7 核仁同源蛋白17抗體 0.2ml Rabbit Anti-mouse IgG-Fc/Cy5.5 Cy5.5標(biāo)記的兔抗小鼠IgG-Fc 規(guī)格: 0.1mlHCG alpha(4A8) 人絨毛膜促性激素α 亞基單抗 規(guī)格: 0.1ml PAX6 轉(zhuǎn)錄因子Pax6抗體 規(guī)格: 0.2mlGoat Anti-Guinea pig IgG/HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml CACNB2 L-型電壓依賴型鈣通道β抗體 規(guī)格: 0.1mlPDCD2L/MGC13096 程序性細(xì)胞死亡2抗體 規(guī)格: 0.2ml EPB42/protein 4.2 紅細(xì)胞膜蛋白4.2抗體 規(guī)格: 0.2mlET-1 內(nèi)皮素-1抗體 規(guī)格: 0.2ml SynaptotagminVI 突觸蛋白6抗體 規(guī)格: 0.1mlTBX-5 轉(zhuǎn)錄因子Tbx5抗體 0.1ml Phospho-p73(Tyr99) 磷酸化P73瘤抑制基因抗體 規(guī)格: 0.1mlIRGM 免疫相關(guān)鳥苷三磷酸酶基因抗體 規(guī)格: 0.2ml ABCA5 三磷酸苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A亞基5抗體 規(guī)格: 0.2mlMCP1/CCL2 單核細(xì)胞趨化蛋白1抗體 規(guī)格: 0.1ml IL-12 白介素12抗體 規(guī)格: 0.1mlRabbit anti-MG IgG/Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 350標(biāo)記的兔抗爪沙鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml 實(shí)驗(yàn)事項(xiàng): 1. 試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。 2. 加樣:加樣或加試劑時,請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時,前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育"時間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。 3. 孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。 4. 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。 5. 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10μl),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。 6. 反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。 7. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。 |