細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：EGFR和VEGFR抑制劑(BMS-690514)

英文名稱：BMS-690514

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7939

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 PPHLN1 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠極低密度脂蛋白受體(VLDLR)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 INO80E 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠極低密度脂蛋白(VLDL)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 PSMA2 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 RAB17 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α/SDF1A)免疫試劑盒*直銷

人 ASPH 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白抑制因子4(TIMP-4)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 COMMD2 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白抑制因子3(TIMP-3)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 VBP1 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白抑制因子2(TIMP-2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 SPATA24 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白抑制因子1(TIMP-1)免疫試劑盒*直銷

人 MSRB3 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白9/明膠B(MMP-9/Gelatinase B)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 CGGBP1 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白8/中性粒細(xì)胞膠原(MMP-8)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 NUDT10 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠基質(zhì)金屬蛋白7(MMP-7)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

EGFR和VEGFR抑制劑(BMS-690514)TRPV4激活劑(GSK1016790A)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  GSK1016790A1瓶 786-O細(xì)胞株 786-O 低溫運(yùn)輸和保存

MET激酶抑制劑(AMG-337)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg|200mg  AMG-3371個(gè) 0.5mLDNA超濾離心管(90-150KD)  

突變體EGFR變構(gòu)抑制劑  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  EAI0452 ug pCMV5-HA pCMV5-HA 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

GLUT1抑制劑(BAY-876)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  BAY-876250mL MOPS Buffer,1.0M,pH7.4   MOPS Buffer,1.0M,pH7.4   常溫保存

Raf抑制劑(AZ 628)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg  AZ 628100次 植物種屬鑒定PCR Mix 7（質(zhì)體 rpoB） Plant DNA Barcoding PCR Mix -20℃保存

拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II抑制劑（TAS-103雙鹽酸鹽）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  TAS-103 dihydrochloride2 ug pMAL-p4x pMAL-p4x 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

IDO1抑制劑(IDO5L)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  IDO5L葡萄糖酸鹽  20支

DAPK抑制劑(TC-DAPK 6)  1mL(10mM)|10mg|50mg  TC-DAPK 61瓶 RH-35細(xì)胞株 RH-35 低溫運(yùn)輸和保存

p70核糖體S6激酶1抑制劑(S6K1抑制劑)(PF-4708671)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  PF-4708671Todd-Hewitt瓊脂 Todd-Hewitt Agar 250g

Hsp90抑制劑  1mL(10mM)|10mg|25mg|100mg|200mg|500mg  Alvespimycin hydrochloride50mg β-D- 阿糖胞苷 Cytosine β-D-Arabinofuranoside 4℃保存

c-Raf抑制劑(GW 5074)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  GW 507450T 腸道病毒EV71/柯薩奇病毒A16型2聯(lián)PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存