細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：VEGFR抑制劑(ZM 306416)

英文名稱：ZM 306416

產品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

產品貨號：BJ-01X8603

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

人 UBE2S 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽VEGF蛋白免疫共沉淀分析試劑盒  5次

人 COPS8 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽VEGF蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒  25次

人 ATF6 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞BAD蛋白表達流式細胞儀檢測試劑盒  10/20次

人 AP3S2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽載玻片細胞BAD蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 APOBEC3C 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽冰凍切片組織BAD蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 N6AMT1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽石蠟切片組織BAD蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 AP1S1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽載玻片細胞BAD蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 CLDN15 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽冰凍切片組織BAD蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 APOA2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽石蠟切片組織BAD蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 USP33 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞BAD蛋白表達比色法定量檢測試劑盒  10/50 次

人 WWP2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞BAD蛋白表達熒光定量檢測試劑盒  10/50 次

VEGFR抑制劑(ZM 306416)Donkey Anti-Goat IgG/RBITC  羅丹明標記的驢抗羊IgG 規(guī)格: 0.1ml

Transferrin(1F10)  轉鐵蛋白單克隆抗體 規(guī)格: 0.1ml

AEV(Avian Encephalomyelitis virus)  禽腦脊髓毒AEV抗體 0.1ml

Phospho-c-Kit(Tyr721)  磷酸化原基因c-kit抗體 規(guī)格: 0.1ml

VANGL1/LPP2  瘤抑制基因LPP2抗體 規(guī)格: 0.2mlPCDHA5  原鈣粘附蛋白α5抗體 規(guī)格: 0.2ml

Cripto 1 monoclonal  畸胎瘤衍化生因子單克隆抗體 規(guī)格: 0.2ml

IQCC  IQCC蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

DECR1  線粒體2,4-雙烯酰輔A還原1抗體 規(guī)格: 0.1ml

VAT  囊泡乙酰通道抗體 規(guī)格: 0.1ml

DAAM1  形態(tài)發(fā)生紊亂關聯(lián)激活因子1抗體 規(guī)格: 0.1mlKappa Light Chain  k輕鏈抗體 規(guī)格: 0.1ml

Lamin B [Nuclear Envelope Marker]  核纖層蛋白B抗體(細胞核內參) 規(guī)格: 0.1ml