培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細(xì)介紹：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過(guò)鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過(guò)大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

人 MS4A1 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽過(guò)氧亞硝基陰離子清除劑硫化乙醇胍琥珀酸鈉  1毫升/5毫摩爾

人 PRICKLE2 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶Myc標(biāo)簽（Mercaptoethylguanidine sodium succinate）  

人 PMP22 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽超氧陰離子清除劑TEMPOL溶液  1毫升/500毫摩爾

甲型流感 H4N6 (A/Swine/Ontario/01911-1/99) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化氫（H2O2）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒  20次

甲型流感 H8N4 (A/pintail duck/Alberta/114/1979) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽組織脂質(zhì)過(guò)氧化氫（H2O2）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒  20次

甲型流感 H10N3 (A/duck/Hong Kong/786/1979) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽植物脂質(zhì)過(guò)氧化氫（H2O2）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒  20次

甲型流感 H12N5 (A/green-winged teal/ALB/199/1991) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽食物脂質(zhì)過(guò)氧化氫（H2O2）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒  20次

甲型流感 H13N8 (A/black-headed gull/Netherlands/1/00) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）活性TBARS比色法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H15N8 (A/duck/AUS/341/1983) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽組織脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）活性TBARS比色法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H16N3 (A/black-headed gull/Sweden/5/99) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽細(xì)胞脂質(zhì)氫過(guò)氧化物 （HYDROPEROXIDE；LOOH）活性  50次

人 ApoE 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (表達(dá)載體), 帶FLAG標(biāo)簽二甲橙（XYLENOL ORANGE）比色法定量檢測(cè)試劑盒  

CTLA-4抑制劑(Ipilimumab)Factor H  補(bǔ)體因子H抗體 規(guī)格: 0.1ml

ACL6B/BAF53b  肌動(dòng)蛋白樣蛋白6B抗體 規(guī)格: 0.2ml

COMMD10  銅代謝結(jié)構(gòu)域蛋白10抗體 規(guī)格: 0.2ml

TSARG6/DNAJB13  生細(xì)胞凋亡相關(guān)基因6抗體 規(guī)格: 0.1mlMAFbx/Fbx32  泛素蛋白連接抗體 規(guī)格: 0.2ml

TCF3/E2A/E47  轉(zhuǎn)錄因子3抗體（螺旋環(huán)螺旋蛋白HE47） 規(guī)格: 0.2ml

SPINK1/SPINK3  瘤相關(guān)胰蛋白抑制劑1抗體 規(guī)格: 0.1ml

IGF1R/CD221  胰島素樣生因子1受體抗體 規(guī)格: 0.1mlNectin 2/CD112  細(xì)胞粘附分子CD112抗體 規(guī)格: 0.1ml

WFDC5  P53應(yīng)答基因蛋白5抗體 規(guī)格: 0.2ml

CEBP-alpha  轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子C/EBP α 抗體 規(guī)格: 0.1ml

RDH13  脫13抗體 規(guī)格: 0.2mlDog IgM/HRP  辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的兔抗犬IgM抗體 規(guī)格: 0.1ml

Batroxobin  蛇毒巴曲抗體 規(guī)格: 0.2ml