細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：PARP1和PARP2抑制劑(A-966492)

英文名稱：A-966492

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8115

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 ADORA2A 基因全長(zhǎng)ORF克隆人磷脂A2(PL-A2)免疫試劑盒*直銷

人 PDK2 基因全長(zhǎng)ORF克隆人乙醇酸(PGP)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ADRBK2 基因全長(zhǎng)ORF克隆人烯醇式丙酮酸羧激(PCK)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 PKD1L2 基因全長(zhǎng)ORF克隆人烯醇丙酮酸羧激,線粒體(PCK2)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 MICA 基因全長(zhǎng)ORF克隆人葡萄糖酸脫氫(PGD)免疫試劑盒*直銷

人 CHST4 基因全長(zhǎng)ORF克隆人PP2A癌性抑制物(CIP2A)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 FUT9 基因全長(zhǎng)ORF克隆人激1(PGK1)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 BDKRB1 基因全長(zhǎng)ORF克隆人肌醇3激(PI3K)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 PRKACG 基因全長(zhǎng)ORF克隆人化乙酰輔A(PaCoA)免疫試劑盒*直銷

人 ISL1 基因全長(zhǎng)ORF克隆人化腺苷酸活化蛋白激(pAMPK)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ANGPTL7 基因全長(zhǎng)ORF克隆人化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激(pERK)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

PARP1和PARP2抑制劑(A-966492)IRAK-4抑制劑（IRAK inhibitor 2）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  IRAK inhibitor 225mL Bovine Serum Albumin Solution（BSA溶液），1mg/mL Bovine Serum Albumin Solution，1mg/mL 常溫保存

COX-2抑制劑(Nimesulide)  1mL(10mM)|100mg|500mg  Nimesulide100次 柱式DNA膠回收試劑盒 Column DNABACK 常溫保存

p38MAPK抑制劑（SKF-86002）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg  SKF-860022 ug pGL3-promoter pGL3-promoter 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

KCa3.1離子通道抑制劑（NS6180）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  NS6180歐洲藥典培養(yǎng)基（EP標(biāo)準(zhǔn)）  

COX抑制劑(Salicylic acid)  1mL(10mM)|10g|50g  Salicylic acid2 ug pFLAG-CMV-2 pFLAG-CMV-2 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

JAK-3抑制劑(WHI-P97)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  WHI-P97緩沖蛋白胨水（BPW） Buffer peptone water（BPW） 9ml*20支/包

IL-17生成抑制劑(Y-320)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  Y-320100mg 蛋白K干粉 Proteinase K Powder 4℃保存

COX抑制劑（Ketorolac tromethamine salt）  1mL(10mM)|1g|5g  Ketorolac tromethamine salt100mL Sodium Cacodylate Buffer（二甲胂酸鈉緩沖液）,0.1M,pH7.0   Sodium Cacodylate Buffer,0.1M,pH7.0   常溫保存

CXCR2抑制劑(SRT3190)  1mL(10mM)|10mg|50mg  SRT31901 管 JM109(DE3)大腸桿菌 JM109(DE3) E.coli Strain -80℃保存

CRTh2(DP2;GPR44)抑制劑（AZD1981）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  AZD19812 ug pRNA u6.1/neo pRNA u6.1/neo 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

COX-2抑制劑（Firocoxib）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg  Firocoxib10次 水樣病毒沉淀劑 Water Sample Virus Precipitation Reagent 4℃保存