操作規(guī)程 1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí). 2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結(jié)果分析 a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90) 中文名稱(chēng)：CFDA,SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒 英文名稱(chēng)：CFSE Cell Proliferation and Tracking Kit 產(chǎn)品規(guī)格：1000T 產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X6389 CFSE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒是基于一種新型熒光探針CFDA SE的用于細(xì)胞增殖檢測(cè)和細(xì)胞熒光示蹤的檢測(cè)試劑盒。CFDA SE目前被廣泛用于替代MTT法或[3H]-thymidine摻入等其它細(xì)胞增殖檢測(cè)方法。 基于CFDA SE熒光標(biāo)記的細(xì)胞增殖檢測(cè)和[3H]-thymidine摻入、BrdU標(biāo)記獲得的檢測(cè)結(jié)果*一致，但同時(shí)可以提供更多的細(xì)胞增殖信息。使用CFDA SE檢測(cè)可以提供整個(gè)細(xì)胞群中有多少比例的細(xì)胞分裂了1次、2次或更多次數(shù)，同時(shí)如果和其它熒光探針聯(lián)用，可以獲取不同分裂次數(shù)細(xì)胞的其它相關(guān)信息。 CFDA SE 的全稱(chēng)為Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，分子式為C29H19NO11，分子量為557.47。CFDA SE可以通透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶發(fā)性地(spontaneously)并不可逆地和細(xì)胞內(nèi)蛋白的Lysine殘基或其它氨基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并標(biāo)記這些蛋白。在加入熒光探針CFDA SE后大約24小時(shí)，即可充分標(biāo)記細(xì)胞。被CFDA SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)個(gè)月。CFSE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，比以前使用的其它細(xì)胞示蹤熒光探針例如PKH26的熒光更加均一，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均勻。 由于CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均勻和穩(wěn)定，每分裂一次子代細(xì)胞的熒光會(huì)減弱一半，這樣通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)就可以檢測(cè)出沒(méi)有分裂的細(xì)胞，分裂一次的細(xì)胞(1/2的熒光強(qiáng)度)，分離兩次的細(xì)胞(1/4的熒光強(qiáng)度)，分裂三次的細(xì)胞(1/8的熒光強(qiáng)度)以及類(lèi)似的其它分裂次數(shù)的細(xì)胞。 CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可以用于成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞等其它細(xì)胞的增殖檢測(cè)，甚至還可以用于細(xì)菌增殖的檢測(cè)。 |
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備： 1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細(xì)胞處理： 1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。 2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)方法： 1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細(xì)胞復(fù)蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。 3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。 Ovine Adenovirus綿羊腺病毒LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Goatpox Virus(GTPV)山羊痘病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Polyoma Virus(Py)多瘤病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒，停產(chǎn) 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Fructus oryzae germinatus稻芽PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Herba violae紫花地丁LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 Plumula nelumbinis 蓮子心探針?lè)≒CR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周 ESBL-Escherichia coli超廣譜β-內(nèi)酰胺大腸桿（大腸埃希氏）LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Tick-borne Encephalitis Virus(TBEV)蜱傳腦炎病毒RT-LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Pseudocowpox Virus(PCPV)偽牛痘病毒LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 甲型流感/乙型流感雙重RT-PCR試劑盒 定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Classical Swine Fever Virus-Vaccine(CSFV-Vaccine)豬瘟病毒疫苗株RT-LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 Marek's Disease Virus(MDV)馬立克氏病病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周 CFDA,SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒細(xì)胞過(guò)氧化物（peroxidase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 20次 細(xì)胞總抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量檢測(cè)試劑盒 50次 瓊脂培養(yǎng)基L 英文名稱(chēng)：Agar medium L 產(chǎn)品規(guī)格：250g 細(xì)胞ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒 50次 通用型肌酐（CREATININE）化學(xué)比色法定量檢測(cè)試劑盒 50次 ?石蠟切片組織COLLAGEN III蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測(cè)試劑盒 10/20次 組織銅離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒 20次 兔血漿 英文名稱(chēng)：Rabbit plasma 產(chǎn)品規(guī)格：0.5ml*10 支原體肉湯培養(yǎng)基 英文名稱(chēng)：Mycoplasma Broth Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 培養(yǎng)基P 英文名稱(chēng)：Medium P (Reinfored medium for clostridia) 產(chǎn)品規(guī)格：250g D-發(fā)酵管（芽孢桿菌） 英文名稱(chēng)： 產(chǎn)品規(guī)格：20支
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