細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：EGFR抑制劑（PD153035 Hydrochloride）

英文名稱：PD153035 Hydrochloride

產品規(guī)格：5mg|10mg|50mg|100mg

產品貨號：BJ-01X8475

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

狗 GDF2 基因全長ORF克隆*氨基酸補充溶液（1X）  100毫升

狗 HGF 基因全長ORF克隆*氨基酸補充溶液（10X）  100毫升

狗 GFRA1 基因全長ORF克隆青鏈混合液  100毫升

狗 ACVR1B 基因全長ORF克隆精制胎牛血清  500毫升

狗 CXCL16 基因全長ORF克隆新生牛血清  500毫升

狗 FGF18 基因全長ORF克隆無胎牛血清（活性碳/葡聚糖處理）  100毫升

狗 CCL25 基因全長ORF克隆血清活性碳/葡聚糖處理試劑盒  5次（1升）

狗 CXCL13 基因全長ORF克隆胰蛋白中和液  100毫升

狗 CCL26 基因全長ORF克隆細胞培養(yǎng)細污染定性熒光檢測試劑盒  20次

狗 CXCL12 基因全長ORF克隆細胞培養(yǎng)病毒污染溶斑法結晶紫染色試劑盒  20次

狗 GDF9 基因全長ORF克隆細胞培養(yǎng)病毒污染溶斑法中性紅染色試劑盒  20次

EGFR抑制劑（PD153035 Hydrochloride）葡萄糖  20支

2 ug pCDF pCDF 低溫運輸，-20℃保存

氯化鈉營養(yǎng)瓊脂 NaCl Nutrient Agar 250g

5g 代乙酰胺 Iodoacetamide 4℃保存

50T 莫氏立克次體PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

1瓶 NIH 3T3細胞株 NIH 3T3 低溫運輸和保存

100mL Ammonium Sulfate Solution, Saturated(飽和硫酸銨溶液） Ammonium Sulfate Solution, Saturated 常溫保存

10mL DNA 非變性PAGE上樣液 DNA Native-PAGE Loading Buffer -20℃保存

2 ug pGEM 3ZF（+） pGEM 3ZF（+） 低溫運輸，-20℃保存

制檢定培養(yǎng)基 Nystatin Test Medium 250g

1瓶 DCS (肉瘤細胞)細胞株 DCS (肉瘤細胞) 低溫運輸和保存