操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：MAP2K1/MEK1抑制劑(RO4987655)

英文名稱：RO4987655

產品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg

產品貨號：BJ-01X8060

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

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MAP2K1/MEK1抑制劑(RO4987655)VEGFR2抑制劑(NVP-BAW2881)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  NVP-BAW2881100mL Kinase Buffer VI,5X  Kinase Buffer VI,5X  常溫保存

孕酮受體激動劑（Medroxyprogesterone）  1mL(10mM)|100mg|500mg|1g  Medroxyprogesterone5ug 10 nt隨機引物 Octomer -20℃保存

雄激素受體抑制劑（17α-Methyltestosterone）  1mL(10mM)|1g  17α-Methyltestosterone2 ug pLVPTH2-tTR-KRAB-Cerulean (1775 ng) pLVPTH2-tTR-KRAB-Cerulean (1775 ng) 低溫運輸，-20℃保存

雌激素受體激動劑(Dienestrol)  1mL(10mM)  DienestrolISP培養(yǎng)基3 ISP Medium 250g

醛固酮合酶抑制劑(BI 689648)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg  BI 6896481瓶 PATU-8988/FU細胞株 PATU-8988/FU 低溫運輸和保存

PTB-1B抑制劑(MSI-1436 lactate)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg  MSI-1436 lactateMSA培養(yǎng)基 MSA Medium 250g

醛糖還原酶抑制劑（Alrestatin）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  Alrestatin2 ug pGEX-4T- 1 pGEX-4T- 1 低溫運輸，-20℃保存

孕酮受體激動劑（Dienogest）  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Dienogest500mL Tris-HCl Buffer,1.0M,pH9.5   Tris-HCl Buffer,1.0M,pH9.5   常溫保存

甲狀旁腺合成和分泌抑制劑（Impurity of Doxercalciferol）  10mg|25mg  Impurity of Doxercalciferol5mL 蛋白抑制劑混合液2 Phosphotase Inhibitor Cocktail 2 4℃保存

芳香酶抑制劑（Aminoglutethimide）  1mL(10mM)|100mg|500mg  Aminoglutethimide2 ug pTrxFus pTrxFus 低溫運輸，-20℃保存

AR激動劑(BMS-564929)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  BMS-5649291次 96孔板血液DNAout（真空法） 96 Microwell Plate Blood DNAOUT 常溫