細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：B-Raf抑制劑(HG6-64-1)

英文名稱：HG6-64-1

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7845

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

棉酚

英文名：   Gossypol

英文別名：   2,2’-bis(1,6,7-trihydroxy-3-methyl-5-isopropyl-8-aldehydonaphthalene)

CAS登錄號：   303-45-7

分子式：   C30H30O8

總大豆皂苷B

CAS登錄號：   新品待定

分子式：   （見結(jié)構(gòu)式圖）

分子量：   （見結(jié)構(gòu)式圖）

分子結(jié)構(gòu)：     

葒草素-2"-0-B-L半乳糖苷

英文名：   2"-O-beta-L-galactopyranosylorientin

英文別名：   2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-8-(2-O-beta-L-galactopyranosyl-beta-D-glucopyranosyl)-5,7-dihydroxy-4H-1-Benzopyran-4-one

CAS登錄號：   861691-37-4

分子式：   C27H30O16

七葉皂苷D

英文名：   AescinIIB

英文別名：   ESCIN IIB

CAS登錄號：   219944-46-4

分子式：   C55H86O24

七葉皂苷C

英文名：   Aescin IIA

英文別名：   Escin IIA

CAS登錄號：   158732-55-9

分子式：   C55H83O24

土槿皮丙酸

英文名：   Pseudolaric Acid C

CAS登錄號：   82601-41-0

分子式：   C21H26O7

分子量：   390.43

土槿皮乙酸-葡萄糖苷

英文名：   Pseudolaric acid B-O-β-D-glucopyranoside

CAS登錄號：   新品待定

分子式：   C29H38O13

分子量：   594.60

土槿皮甲酸-葡萄糖苷

英文名：   Pseudolaric acid A-O-β-D-glucopyranoside

CAS登錄號：   新品待定

分子式：   C28H38O11

分子量：   550.59

大豆皂苷Ba

英文名：   Soyasaponin Ba

英文別名：   Soyasaponin V

CAS登錄號：   114590-20-4

分子式：   C48H78O19

賽門苷I

英文名：   Siamenoside I

英文別名：   (3beta,9beta,10alpha,11alpha,24R)-3-(beta-D-Glucopyranosyloxy)-11,25-dihydroxy-9-methyl-19-norlanost-5-en-24-yl O-beta-D-glucopyranosyl-(1-2)-O-[beta-D-glucopyranosyl-(1-6)]-beta-D-glucopyranoside

CAS登錄號：   126105-12-2

分子式：   C54H92O24

11-0-羅漢果苷V

英文名：   11-oxo-mogroside V

英文別名：   (24R)-3β-[6-O-(β-D-Glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyloxy]-24-[2-O,6-O-bis(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyloxy]25-hydroxycucurbita-5-ene-11-one

CAS登錄號：   126105-11-1

分子式：   C60H100O29

B-Raf抑制劑(HG6-64-1)Masson三色染色試劑盒  6×100mL  Masson Staining Kit500mL Blotto in TBS   Blotto in TBS   常溫保存

姬姆薩染色液(吉姆薩染液)  250mL  Giemsa Staining Solution1g 分子生物學(xué)級糖原干粉 Glycogen Powder 常溫

0.5%焦油紫染色液  50mL  Tar purple Staining Solution2 ug pGL4.30[Luc2P/NFAT-RE/Hygro] pGL4.30[Luc2P/NFAT-RE/Hygro] 低溫運輸，-20℃保存

蘇木素染色液(Gill法)  15mL  Hematoxylin Staining Solution煌綠瓊脂培養(yǎng)基 Brilliant Green Agar Medium 250g

Bielschowsky改良法神經(jīng)組織染色試劑盒  5×50mL  Modified Bielschowsky nerve Staining Kit1瓶 HCCLM3細(xì)胞株 HCCLM3 低溫運輸和保存

改良型天狼猩紅染色試劑盒  100mL  Enhanced Sirius Red Straining Kit10次 百萬堿基級真菌DNAout  

糖原PAS染色液(真菌專用)  3×50mL  Glycogen PAS stain (for fungi)500U Tth 核酸內(nèi)切 IV Tth Endonuclease IV -20℃保存

甲基綠染色液  100ml  Methyl Green Staining Solution250mL RIPA Buffer—2  RIPA Buffer—2  常溫保存

尼氏染色液(Nissl染色液)  100ml  Nissl Staining Solution1 管 DH10B大腸桿菌 DH10B E.coli Strain -80℃保存

甲基綠-派洛寧染色液(MGP染色液)  100ml  Methyl Green-Pyronin Staining Solution2 ug pREV pREV 低溫運輸，-20℃保存

棉藍(lán)乳酚油染色液  250mL  Lactic Acid Phenol Cotton Blue Staining SolutionO157菌成套生化鑒定管  11種*1套/盒*10盒